Identification and analysis of novel virulence-defective Rhodococcus fascians mutants

Rhodococcus fascians é uma actinomiceta fitopatogénica que induz uma doença, conhecida como irritação frondosa, caracterizada pela indução de múltiplos rebentos, numa vasta gama de plantas herbáceas dicotiledóneas. O principal factor de patogenicidade da bactéria é a produção de uma mistura de 6 citoquininas codificadas pelos genes do operão fas que está localizado num plasmídeo linear associado à virulência, pFiD188. Este trabalho teve como objectivo a análise de dois novos loci deste plasmídeo associados à virulência: GT1 que codifica uma glicosiltransferase e os genes mtr1 e mtr2, grandemente homólogos, que codificam metiltransferases dependentes de SAM. Trabalhos prévios com 21D5, mutante na glicosiltransferase, mostraram que possui uma morfologia de colónia modificada e forma agregados em culturas líquidas. Neste trabalho demonstrou-se que essas características não afectam o crescimento em meio de cultura rico, mas levam à incapacidade de proliferação em condições de privação de nutrientes, tendo um impacto forte na competência epifítica. Este impacto foi demostrado pela atenuação severa da virulência em 21D5, que foi acompanhada de uma expressão alterada dos genes fas e att, essenciais para a virulência, e consequente redução da capacidade de invasão dos tecidos da planta e de produção dos factores de virulência. Demonstrou-se também que a expressão de GT1 é induzida por compostos que são acumulados em plantas nas fases iniciais da infecção, colocando a função de GT1 no começo da interacção. Tal como R. fascians, Streptomyces turgidiscabies possui um operão fas e dois genes mtr associados. R. fascians mutantes nestes genes mtr’s perderam a capacidade de provocar sintomas, mas produziram 2MeS-citoquininas, implicando que outras citoquininas metiladas são cruciais para a indução da doença. De modo a identificar os produtos de reacção das MTRs procedeu-se à análise do perfil de citoquininas de R. fascians em condições que induzem a expressão dos genes do operão fas e de S. turgidiscabies alimentados com SAM e adenina marcadas com 14C em TLC. No entanto, não foi possível a identificação de compostos dependentes de fas ou mtr nos sobrenadantes. Pela determinação do perfil de expressão dos genes mtr in vitro e in planta tornou-se claro que a regulação destes genes é muito complexa, sendo a sua expressão limitada a células de R. fascians que colonizam o hospedeiro. Para possibilitar a identificação dos produtos de recção de MTR, desenvolveu-se um protocolo que permite a expressão in planta em condições in vitro, o que permitirá a repetição dos ensaios de marcação com 14C.

Estudo da infeção de corvina (Argyrosomus regius Asso, 1801) por Photobacterium damselae subsp. piscicida

As práticas intensivas que são utilizadas em aquacultura implicam que exista um contacto extremo entre indivíduos promovendo o stress, que atuando conjuntamente com diversos outros fatores, como é o caso de bactérias, são passíveis de induzir nos peixes um estado de doença. Photobacterium damselae subsp. piscicida (Phdp) é uma bactéria gram-negativa reconhecida por causar surtos graves de doença em diversas espécies de peixes. É considerada mundialmente como uma das maiores enfermidades para as práticas aquícolas, plausível de causar danos irreversíveis nestas populações. Neste trabalho pretendeu-se elaborar um protocolo de infeção com Phdp em Argyrosomus regius estabelecendo num primeiro ensaio a dose que causa mortalidade a 50% de uma população (LD50), estudando posteriormente num segundo ensaio, a infeção, o destino que a bactéria teria no peixe através de análise PCR, as consequências da infeção a nível hematológico e nos parâmetros imunitários, utilizando um modelo de coabitação, expondo indivíduos saudáveis a indivíduos doentes. Foi comprovada a virulência da estirpe AQP 17.1 de Phdp sobre indivíduos da espécie A. regius com um peso médio de 28,3±10,9g, situando-se o LD50 em 2,29×105 UFC ml-1, apresentando os peixes alguns sintomas típicos da doença crónica. O modelo de coabitação utilizado no segundo ensaio, permitiu-nos confirmar que Phdp infetou por coabitação indivíduos da espécie A. regius com peso médio de 23,4±8,6g. Os resultados sugerem que as brânquias podem ter sido um dos locais de entrada da bactéria no corpo do peixe, disseminando-se após 24 horas para o rim e intestino anterior. Phdp induziu em A. regius uma resposta imune inata que se avaliou ao longo do tempo quando comparados os indivíduos coabitantes do controlo (vetores injetados com tampão salino de Hanks) com os indivíduos coabitantes infetados (vetores injetados com suspensão de Phdp a uma concentração igual ao LD50). Esta resposta inflamatória ficou visível não só no aumento do número de leucócitos no sangue, mas também no aumento de atividade dos parâmetros humorais imunes. Os resultados sugerem que a maior atividade da resposta imunitária se deu após as 24 horas de coabitação, momento que determina também a invasão do patógeno em órgãos como o intestino anterior e o rim. Os resultados obtidos neste trabalho sugerem que Phdp pode induzir um estado de infeção em A. regius através de um modelo de coabitação, invadindo num curto espaço de tempo os órgãos do hospedeiro, desencadeando a atividade do sistema imune inato como resposta à infeção.